| Arabic | English | French |
| نكليوزيدات | Nucleosides | Nucléosides |
| نكليوتيدات | Nucleotides | Nucléotides |
| أحماض نووية | Nucleic acids | Acides nucléiques |
| دنا، رنا | DNA, RNA | ADN, ARN |
تحديد الأحماض النووية دنا و رنا - Nucleic acids (DNA, RNA). Spectrophotometry quantification : الطريقة الأكثر شيوعًا لتحديد تركيز الأحماض النووية هي امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي 260 نانومتر لكون الامتصاص يعد أبسط ويتطلب معدات مختبرية شائعة مثل: جهاز قياس الطيف الضوئي (مطياف) المزود بمصباح الأشعة فوق البنفسجية، وحاويات شفافة للأشعة فوق البنفسجية ومحلول من الحمض النووي النقي. علاوة على ذلك، فإن الطريقة غير مدمرة وسريعة. تكمن المشكلة الوحيدة في حساسية الطريقة، إذ تبقى محدودة. ويحتاج المرء إلى عينة لا تقل عن 1 ميكروغرام/مل لتقدير الحمض النووي الناقص الأكسيجين أو دنا (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) بشكل صحيح. مشكلة أخرى هي أن الطريقة لا يمكنها التمييز بين الحمض النووي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA). المشكلة الثالثة هي أنه لا يمكن استخدامها مع المستخلصات غير النقية (مستحضرات خام).
The most common method for determining nucleic acid concentration is UV absorption at 260 nm. This method is simpler and requires common laboratory equipment such as a spectrophotometer equipped with a UV lamp, UV-transparent containers, and a solution of purified DNA. Furthermore, the method is rapid and non-destructive. The only problem is its limited sensitivity. A sample of at least 1 µg/ml is needed to accurately quantify DNA and RNA. A second problem is that the method cannot distinguish between DNA and RNA and the third problem is that it cannot be used with impure extracts (crude preparations).
Three components make up the nucleic acids DNA and RNA: 1/ A pentose (ribose or deoxyribose), 2/ A nitrogenous base (A, G, C, T (or U) and 3/ phosphoric acid
1 سؤال .
مكون الأحماض النووية المسئول عن امتصاص الضوء في الأشعة فوق البنفسجية هو:
The component of nucleic acids responsible for the absorption of light in the ultraviolet is:
(!السكر الخماسي - Pentose)(القاعدة النيتروجينية - Nitrogen base)(!الفسفات - Phosphate)(!الروابط الهيدروجينية - Hydrogen bonds)
القواعد اليتروجينية عطرية بطبيعتها، ولها روابط مزدوجة متبادلة، مما يؤدي إلى تسطح بنيتها. وتمتلك هذه القواعد نظامًا إلكترونيًا مترافقًا يكون من وراء امتصاص الضوء.
يمكن أن يكون هيكل الحمض النووي الريبوزي (RNA) معقدًا، مع وجود بعض المناطق الحلزونية بينهما، حيث تترابط القواعد الهيدروجينية وتتراكم فوق بعضها البعض.
The bases are aromatic in nature and have alternate double bonds, which leads to planarity of their structures. These have conjugated electron system.
Structure of RNA can be complex with some helical regions in between, where bases hydrogen bond and stack over each other.
تتميز القواعد الأزوتية بأطياف للامتصاص (absorption spectra) مختلفة، لكن أغلبها يكون في طول موجي ب 260 نانومتر (wavelength 260 nm). للقواعد الأزوتية من نوع البورين (ذات حلقتين، A و G) امتصاص أعلى، مقارنة مع القواعد من نوع البيريميدين (ذات حلقة واحدة، C و T و U)، كما يوضحه الرسم التالي. لهذا، يستعمل قياس امتصاص الضوء بهذا الطول الموجي في وضع تقديرات لتركيزات الأحماض النووية مثل DNA. تتميز محاليل القواعد الأزوتية (في شكل حر) بامتصاص مرتفع للأشعة فوق البنفسجية (ظاهرة مفرط الصباغ، Hyperchromicity) مقارنة بامتصاصها و هي داخل بنيات الأحماض النووية التي تحجب تعرضها للأشعة (نتكلم هنا عن ظاهرة RNA نقص الصباغ، Hypochromicity). تظهر الأحماض النووية امتصاصًا قويًا في المنطقة 240-270 نانومتر (الشكل). ينشأ كتركيبة من عدد من التحولات بسبب الطبيعة العطرية للقواعد A وT وG وC وU. تبلغ ذروة امتصاص الحمض النووي حوالي 260 نانومتر.
يعتمد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بواسطة الأحماض النووية أيضًا على بنيتها (خيط مزدوج، خيط مفرد) وحالة التحلل المائي. وبالتالي، فإن الامتصاص (الكثافة البصرية، OD) لمحلول الأحماض النووية عند 260 نانومتر تساوي 1 يتوافق مع تركيزات 50 ميكروجرام/مل و37 ميكروجرام/مل من الحمض النووي مزدوج السلسلة والحمض النووي أحادي السلسلة، على التوالي. وهو يتوافق مع تركيز يعادل 40 ميكروجرام/مل للحمض النووي الريبوزي أحادي السلسلة.
سؤال 1.
اختر من بين تسلسلات هياكل الحمض النووي المدرجة أدناه التسلسل الذي يتوافق مع الكثافات البصرية عند 260 نانومتر والتي تساوي 0.38 و 0.61 على التوالي؟ - القراءة من اليمين إلى اليسار
Choose from the sequences of DNA structures listed below the one that corresponds to optical densities at 260 nm equal to 0.38 and 0.61, respectively? - reading from right to left(!DNA أحادي السلسلة - DNA مزدوج السلسلة.
Single-stranded DNA - double-stranded DNA.)(الحمض النووي مزدوج السلسلة - الحمض النووي أحادي السلسلة.
double stranded DNA - Single-stranded DNA.)
- تنقية الحمض النووي دنا (DNA) المستخلص من النبات
PURIFICATION OF PLANT DNA
بروتوكول تنقية الحمض النووي من النباتات التي تم تطبيقها للحصول على مستخلص الحمض النووي أكثر أو أقل تم تلخيص عملية التنقية في الشكل أدناه.
يمكن تقييم درجة تقدير DNA بواسطة القياس الطيفي (فيديو توضيحي للقياس الطيفي) من خلال قياس الكثافة البصرية (A) عند 260 نانومتر (الأحماض النووية) و280 نانومتر (البروتينات).
- علاقة A260/A280 تشتمل على 1,8 و2 تتوافق مع محلول DNA نقي.
- تشير نسبة أقل من 1.7 إلى تلوث بالبروتينات.
- علاقة أعلى من 2 يدل على تلوث دنا ب رنا (RNA).
- علاقة A260/A280 قريبة من 2 تشهد على ثراء الأحماض النووية (DNA + RNA).
ملاحظة: تختلف النسبة A260/A280 حسب الرقم الهيدروجيني والقوة الأيونية. يتناقص في بيئة حمضية ويزيد من وسط قاعدي. يتم تصحيح الخطأ باستخدام أنبوب شاهد بنفس درجة الحموضة. أيضًا، يعتمد تكوين DNA على القواعد الآزوتية
يعكس الامتصاص عند 230 نانومتر تلوث المستخلص بواسطة جزيئات أخرى مثل الجلوكوز والبروتينات والفينولات والمركبات العطرية (+ EDTA, ). بالنسبة لمستخلص DNA نقي، فإن العلاقة A260/A230 هو حوالي 2 إلى 2,2.
- معالجة الحمض النووي النقي
Processing of purified DNA
من أجل تقييم الحمض النووي للنبات عن طريق التحليل الطيفي الضوئي، تمت تنقيته أولاً وفقًا للبروتوكول الموضح أدناه، ويخضع لثلاث معالجات:
- العلاج A الذي يعطي A DNA :
50 ميكرولتر من
مستخلص الحمض النووي النقي المخفف بالماء ليصبح الحجم الإجمالي 2 مل.
- العلاج B يعطي B DNA:
50 ميكرولتر من الحمض النووي
منقى + 5 ميكرولتر من RNase. يتم تحضير المحلل المائي بما يصل إلى 2 مل من الماء.
- العلاج C يعطي C DNA (دنا ناقص XMP):
50 ميكرولتر من الحمض النووي النقي + 5 ميكرولتر من RNase. المُحلل المائي المحصل عليه يستكمل بالماء حتى 2 مل. يتم ترسيب XMPs الحرة من مُحلل الحمض النووي الريبوزي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية بواسطة 150 ميكرولتر من الإيثانول و15 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم. بعد عملية الطرد المركزي، يتم استعادة الراسب وإذابته في الماء المقطر ثم إضافة الماء حتى 2 مل.
- العلاج D يعطي D DNA - يتم بتر الحمض النووي من XMPs ويتم تغيير طبيعته باستخدام درجة الحرارة -: 50 ميكرولتر من الحمض النووي النقي + 5 ميكرولتر من RNase. يتم إضافة المزيد من الماء للمحلل المائي حتى 2 مل. يتم إزالة XMPs الموجودة في المُحلل المائي كما في العلاج C. ثم يتم مسخ الحمض النووي عبر التسخين 5 دقائق عند 100 درجة مئوية، يتم امتصاصها في الماء وإكمالها إلى 2 مل بالماء المقطر.
In order to evaluate plant DNA by spectrophotometry, it was first purified according to the protocol described below and subjected to three treatments:
- Treatment A, which yields A DNA:
50 µl of purified DNA extract diluted with water to a total volume of 2 ml.
- Treatment B gives B DNA:
50 µl of purified body systems + 5 µl of RNase. The hydrolyzate is made up to 2 ml with water.
- Treatment C yields C DNA (XMP-minus DNA): 50 µl of purified DNA + 5 µl of RNase. The resulting aqueous solution is supplemented with water to 2 ml. Free XMPs are precipitated from the RNA solution at -20°C with 150 µl of ethanol and 15 µl of sodium acetate. After centrifugation, the precipitate is recovered and dissolved in distilled water, followed by the addition of water to make up to 2 ml.
- Treatment D yielding DNA D - DNA amputated of XMPs and denatured with temperature -: 50 µL of purified DNA + 5 µL of RNase. The hydrolyzate is made up to 2 mL with water. The XMPs in the hydrolyzate are removed as in treatment C. The DNA is then denatured for 5 min at 100°C, taken up in water and made up to 2 mL with distilled water.
 |
 |
 |
 |
- نتائج اختبارات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للأحماض النووية المعالجة مسبقًا
Results of UV absorbance tests of pre-treated nucleic acids
بعض البيانات للمساعدة في تفسير النتائج
Some data to help in interpreting the results:
A ADN A = DNA + RNA
B RNA = DNA + hydrolyzed RNA (الحمض النووي الريبوزي المحلل)
C DNA = DNA alone (الحمض النووي الريبوزي المحلل والمُزاح, Hydrolyzed and eliminated RNA)
D DNA = الحمض النووي المتحلل عن طريق التسخين إلى 100 درجة مئوية (DNA denatured by heating to 100°C).النتيجة: - حمض نووي أحادي السلسلة - Result: Single-stranded DNA -
Extinction coefficient of nucleic acids at 260 nm
معامل الاندثار المولي عند 260 نانومتر:
- الحمض النووي دنا مزدوج السلسلة - Double-stranded DNA: 0,020 (µg/mL)-1 cm-1 or molar extinction coefficient: 6200 M-1. cm-1 or standard coef.: 50 (mg/mL)-1.cm-1)
- الحمض النووي دنا أحادي السلسلة - Single-stranded DNA: 0,027 (µg/mL)-1 cm-1 or molar extinction coefficient: 8350 M-1. cm-1 or standard coef.: 33 (mg/mL)-1.cm-1
- الحمض النووي الريبوزي أحادي السلسلة - Single-stranded RNA: 0,025 (µg/mL)-1 cm-1 or molar extinction coefficient: 7700 M-1. cm-1 or standard coef.: 40 (mg/mL)-1.cm-1
تركيزات الأحماض النووية عند 260 نانومتر المقابلة لـ OD = 1:
Nucleic acid concentrations at 260 nm corresponding to OD = 1:
- الحمض النووي دنا مزدوج السلسلة - Double-stranded DNA: 50 µg/mL.
- الحمض النووي دنا أحادي السلسلة - Single-stranded DNA: 37 µg/mL
- الحمض النووي الريبوزي أحادي السلسلة - Single-stranded RNA: 40 µg/mL
سؤال
برأيك، أي DNA (A، B، C، D) يجب أن يكون له أدنى ذروة امتصاص عند 260؟
In your opinion, which DNA (A, B, C, D) should have the lowest absorption peak at 260? - Check the correct answer.(!A DNA)(!B DNA)(C DNA)(!D DNA)
1 سؤال .
يعتمد تقدير كمية الأحماض النووية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية على قانون بير-لامبرت.
The Beer-Lambert law is behind UV quantification of nucleic acids.
(!خطأ - False)(صحيح - True)
2 سؤال .
الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية المستخدم لإجراء تقدير كمية الأحماض النووية هو:
The UV wavelength used to perform nucleic acid quantification is:
(!230 nm)(260 nm)(!320 nm)(!280 nm)
3 سؤال .
أي مما يلي لا يستخدم في تحديد كمية الأحماض النووية؟
Which of the following is NOT used in nucleic acid quantification?
(! قياس الامتصاصية بطول موجة 260 نانومتر
Measurement of absorbance at 260 nm)(فحص لوري
Lowry assay)(!قياس الفلورسنت -مثال كيوبت-
Fluorometry -example Qubit- )(!مطيافية نانودروب
Nanodrop spectrophotometey )
4 سؤال .
يتمتع الحمض النووي دنا أحادي السلسلة بامتصاص أعلى للأشعة فوق البنفسجية من الحمض النووي ثنائي السلسلة في نفس التركيز.
Single-stranded DNA has a higher UV absorbance than double-stranded DNA at the same concentration.
(!خطأ - False)(صحيح - True)
5 سؤال .
ما هو التركيز التقريبي (بالميكروجرام/مل) لـ دنا ثنائي الأطراف إذا كانت الامتصاصية في 260 نانومتر تساوي 1.0 ؟
What is the approximate concentration (in µg/mL) of dsDNA if the A260 reading is 1.0?
(50 µg/mL )(!20 µg/mL )(!33 µg/mL)(!100 µg/mL)(!150 µg/mL)
6 سؤال .
يمتص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأشعة فوق البنفسجية بشكل مشابه للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)، ولكن غالبًا ما تختلف نسبة A260/A280 اختلافًا طفيفًا. النسبة المتوقعة للحمض النووي الريبوزي النقي هي:
RNA absorbs UV light similarly to DNA but often has a slightly different A260/A280 ratio. The expected ratio for pure RNA is:
(!~1.0)(!~1.6 )(!~1.8 )(~2.0)(!~2.2)
7 سؤال .
يتم استخدام نسبة A260/A230 لتقييم تلوث البروتين في عينات الأحماض النووية
The A260/A230 ratio is used to assess protein contamination in nucleic acid samples
(خطأ - False)(!صحيح - True)
سؤال 1:يربط قانون بير-لامبرت (A = εlc) الامتصاص (A) بالتركيز (c) وطول المسار (l، عادةً 1 سم).
.The Beer-Lambert law (A = εlc) relates absorbance (A) to concentration (c) and path length (l, generally 1 cm).
سؤال 3:يقيس اختبار لوري تركيز البروتين، وليس الأحماض النووية. يتم استخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (عند 260 نانومتر)، والفلورومترية (Qubit)، والنانودروب للحمض النووي دنا / الحمض النووي الريبي.
The Lowry assay measures protein concentration, not nucleic acids. UV absorbance (at 260 nm), fluorometry (Qubit), and nanodrop are used for DNA/RNA.
سؤال 4: يمتص الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) ما يقرب من 10-15% من الأشعة فوق البنفسجية أكثر من الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) بسبب تأثير الفرط الكرومي الناتج عن القواعد الأكثر تعرضًا.
Single-strand DNA (ssDNA) absorbs ~10-15% more UV than double-strand DNA (dsDNA) because of the hyperchromic effect due to more exposed bases.
سؤال 5:
يمكن حساب تركيز الحمض النووي من قياس OD عند 260 نانومتر باستخدام عامل الارتباط. بالنسبة لـ DO = 1، لدينا:
- 50 ميكروجرام/ميليلتر من الحمض النووي مزدوج السلسلة (معامل الاندثار المولي: 6200 M-1. cm-1)
- 33 ميكروجرام/ميليلتر من الحمض النووي أحادي السلسلة (مثل الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة) (معامل الاندثار المولي: 8350 M-1. cm-1)
- 40 ميكروجرام/ميليلتر من الحمض النووي الريبي (معامل الاندثار المولي: 7700 M-1. cm-1)
------------
طريقة احتساب تركيز الحمض النووي دنا:
يُقدَّر تركيز الحمض النووي بقياس الامتصاصية عند طول موجي 260 نانومتر، وتعديل قياس A260 للعكارة (turbidity - المُقاسة بالامتصاصية عند طول موجي 320 نانومتر)، وضربه في عامل التخفيف، ثم استخدام العلاقة التي تنص على أن قيمة A260 البالغة 1.0 = 50 ميكروغرام/مل من الحمض النووي ثنائي الأطراف النقي.
التركيز (ميكروغرام/مل) = (قراءة A260 - قراءة A320) × عامل التخفيف × 50 ميكروغرام/مل
مع ذلك، ليس الحمض النووي (DNA) الجزيء الوحيد القادر على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي 260 نانومتر. فبما أن الحمض النووي الريبي (RNA) يتمتع أيضًا بامتصاصية عالية عند طول موجي 260 نانومتر، وأن الأحماض الأمينية العطرية الموجودة في البروتين تمتص عند طول موجي 280 نانومتر، فإن وجود كلا الملوثين في محلول الحمض النووي (DNA) سيساهم في القياس الكلي عند طول موجي 260 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك، سيؤدي وجود الغوانيدين إلى امتصاصية أعلى عند طول موجي 260 نانومتر. هذا يعني أنه في حال استخدام الرقم A260 لحساب العائد، فقد تكون كمية الحمض النووي (DNA) مُبالغًا فيها.
لتقييم نقاء الحمض النووي (DNA)، يُقاس الامتصاصية من 230 إلى 320 نانومتر للكشف عن أي ملوثات محتملة أخرى. الطريقة الأكثر شيوعًا لحساب النقاء هي نسبة الامتصاصية عند 260 نانومتر مقسومة على القراءة عند 280 نانومتر. تتراوح نسبة A260/A280 في الحمض النووي عالي الجودة بين 1.7 و2.0. لا تعني القراءة 1.6 أن الحمض النووي غير مناسب لأي تطبيق، ولكن انخفاض النسب يشير إلى وجود ملوثات أكثر. يمكن حساب النسبة بعد تصحيح العكارة (الامتصاصية عند 320 نانومتر).
نقاء الحمض النووي (A260/A280) = (قراءة A260 - قراءة A320) ÷ (قراءة A280 - قراءة A320)
DNA concentration can be calculated from the OD measurement at 260 nm using a correlation factor. For an OD = 1, we have:
- 50 µg/mL of double-stranded DNA (molar extinction coefficient: 6200 M-1. cm-1 or extiction coef.: 0.020 µg/mL.cm-1 or standard coef.: 50 (mg/mL)-1.cm-1)
- 33 µg/mL of single-stranded DNA (molar extinction coefficient: 8350 M-1. cm-1 or extiction coef.: 0.027 µg/mL.cm-1 or standard coef.: 33 (mg/mL)-1.cm-1)
- 40 µg/mL of RNA (molar extinction coefficient: 7700 M-1. cm-1 or extiction coef.: 0.025 µg/mL. cm-1 or standard coef.: 40 (mg/mL)-1.cm-1)
سؤال 6:عادةً ما يكون لدى RNA النقي نسبة A260/A280 تبلغ حوالي ~2.0 بسبب اختلافاته البنيوية (سلسلة واحدة). في الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (RNA): تكون القواعد النيتروجينية أكثر تعرضًا للأشعة فوق البنفسجية (RNA: سلسلة واحدة) مقارنة بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA: سلسلة مزدوجة) حيث تكون القواعد النيتروجينية أكثر إخفاءً.
Pure RNA typically has an A260/A280 ratio of ~2.0 due to its structural differences (single-stranded). In RNA, the nitrogenous bases are more exposed to UV (RNA: single strand) compared to DNA (double strand) where the nitrogenous bases are more masked.
سؤال 7: تتحقق نسبة A260/A230 من الملوثات العضوية (الفينول والأملاح)، في حين تقوم نسبة A260/A280 بتقييم تلوث البروتين.
The A260/A230 ratio checks for organic contaminants (phenol, salts), while A260/A280 assesses protein contamination.
- Nucleic acids (DNA, RNA) - الأحماض النووية دنا و رنا
- النكليوزيدات والنكليوتيدات في الأحماض النووية (دنا، رنا)
Nucleosides and Nucleotides in Nucleic acids (DNA, RNA)
- QCM Nucléosides, Nucléotides
- ACIDES NUCLEIQUES - ADN, ARN - QUANTIFICATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (TRAVAIL PRATIQUE)
- Structures des Acides nucléiques ADN, ARNبنيات الحمض النووي دنا و رنا
Acides nucléiques, ADN, ARN (الأحماض النووية). Exercices
- ADN de plantes. Purification et éléctrophorèse (TP S5)
Faculty of Sciences, Cadi Ayyad University
Marrakech, 40000, Morocco
Email: baaziz@uca.ac.ma
Phone: 212524434649 (post 513)
Fax: 212524434669
